二甲亚砜在-40、-50℃对关节软骨渗出透特性的实验研究
虞效益 张绍志 周正 陈光明
（浙江大学制冷与低温研究所 杭州 310027）
摘要 玻璃化保存被认为是一种很有可能成功保存人体大型组织和器官的方法。为了在通常的急冷条件下达到玻璃化，需要添加高浓度的低温保护剂（CPA）。0℃以上加载高浓度的CPA极可能会对细胞造成致命的毒性损伤，降低毒性损伤的一种有效方法是边降温边提高CPA的浓度。本文实验研究了-40、-50℃时二甲亚砜（Me2So）对绵羊关节软骨的渗透性。把预渗一定浓度Me2So的软骨片浸渗在-40、-50℃的Me2So的溶液中，经过不同时期间隔（5，15，30，60，120min）后取出软骨组织，用分光光度法测量其中Me2So的含量。结果发现，在5min时软骨里的Me2So含量下降，5min后才开始升高，浓度下降现象在-30℃及以上的实验里未曾观察到，这可能是粘度剧增带来的浓度边界层厚度变化的缘故。
关键词 关节软骨；玻璃化保存；二甲亚砜；渗透；低温
0引言
玻璃化保存被认为是一种很有可能成功保存人体大型组织和器官的方法。通常，研究者采用添加混合低温保护剂与快速冷却相结合的方法来实现生物材料的玻璃化[1-4]。近年来，Pegg等人采用了一种名为“液相线跟踪”的方法（Liquidus-tracking，LT）对绵羊关节软骨实施了玻璃化保存，取得了良好的效果[5]，此法的降温速率可以很慢，而且只使用了二甲亚砜（Me2So）一种低温保护剂（CPA）。LT法依据CPA对生物材料的毒性随温度降低的特点，边降温边提高CPA的浓度，从室温直至-70℃。
虽然降低温度可有效降低CPA对生物材料的毒性，但CPA的毒性还与时间有关，接触时间过长同样会对生物材料造成致命的损伤。因此，了解CPA对生物材料的渗透性对合理设计CPA的加载过程意义重大。对于关节软骨，研究者已研究了多种CPA对其的渗透特性[6-9]，但所做研究都仅局限于0℃以上温度位。而0℃以下CPA对关节软骨的渗透特性对优化LT法非常重要，目前国内外未见详细报道。本文作者已对-10、-20、-30℃时，Me2So对绵羊关节软骨的渗透特性进行了研究[10]，在研究-40、-50℃这两个温度位时发现了一个奇特的渗透现象，本文对此实验过程进行了详细描述并对这一奇特现象进行了初步解释。
1材料与方法
1．1取材
软骨取自于成年绵羊大腿关节处。绵羊于当地屠宰场屠宰后，取其关节囊用聚乙烯膜包好并置于放有冰袋的保温箱中送达实验室。取样时，剖开关节囊，用角膜环钻和手术刀从关节的负重部位切削下软骨（直径6mm，厚度0.6~1mm），并立即浸泡由Hepes缓部的平衡溶液（145mM Na+，3.3mM K+，20mM Hepes）中。
1．2实验装置
实验装置如图1所示，实验所需低温（-40、-50℃）由一自行搭建的冷却装置提供。Me2So溶液的温度用四线制铂电阴温度传感器测量并在Agilent 34970A 数据采集单元上显示。软骨片浸渗在离心管中，离心管的底部及侧壁均钻有直径为3mm的孔。离心管可一次性放置七个，均布于搅拌子周围。
1．3标准曲线
配制浓度为18、24、30、36、42、48、54、60mg/L的Me2So标准溶液（所用Me2So为分析纯，水为去离子水）待用。用紫外可见分光光度计（TU-1810PC，北京普析通用有限公司）于208nm处测量各标准溶液的吸光度，得到浓度（C）与吸光度（A）之间的线性关系：A=0.01089+0.01052C，R2=0.999.
1．4实验过程
软骨片随机分成2组（-40、-50℃），详细实验设计如表1所示。每一组的浸渗时间为0、5、15、30、60和120min，每个时间含6片软骨（n=6）。实验具体损伤如下：1）把预先称重的软骨片于是2mL预平衡液中平衡：2）预平衡后取出软骨片用Kimwipes®擦拭纸轻轻擦干，然后在去离子水中快速漂洗一次，再用擦拭纸轻轻擦干；3）浸渗于相应温度和浓度的浸渗夜中，直至经过指定时间后取出；4）取出软骨片，并用与步骤2相同的方法得理；5）放置于2mL的去离子水中，密封并于4℃冰箱冷藏室中过夜，使Me2So完全渗出至去离子水中；6）取0.3mL步骤5所得溶液（Me2So+去离子水）于50mL容量瓶中稀释；7）用此外可见分光光度计于208nm处测量所得稀释液的吸光度，由吸光度值可换算得到原先渗入到软骨片中的Me2So的质量
表1实验设计
Tab.1 Experimental design
组别 预平衡温度 预平衡液浓度a 预平衡时间b 预平衡后软骨中Me2So浓度c 浸渗温度 浸渗液浓度
（℃） （%w/v） （min） （%w/v） （℃） （%w/v）
1 22 55.3 63 49.77 -40 69.8
2 22 60.2 68 54.18 -50 74.2
a. 假设浸渗达平衡时软骨片中Me2So浓度平衡浓度的90%。
b. 预平衡所需时间由文献[11]的结果保守估算得到。
c. 为了防止软骨片在-40、-50℃冻结，软骨片内Me2So的起始浓度根据文献[12]中Me2So/NaC1/H2O三元溶注融点（Tm）与溶质浓度（S）的关系式计算得到，Tm=A·S+ B·S2+ C·S3,式中A=-0.6+0.17tan-1（R/2）132-0.001，C=-4.5×10-4，而R为Me2So与NaC1的质量比。计算时，把浸渗液看成Me2So/NaC1/H2O三元溶液。
软骨中Me2So的浓度表示如下：（Me2So的质量/软骨组织内溶液的体积）×100%，软骨组织内溶液的体积近似为新鲜软骨内水的体积，且忽略温度的影响。新鲜软骨的含水量为77.7%w/w[11]。
2结果与讨论
-40、-50℃时，经过指定时间之后软骨中Me2SO的浓度如表2所示。从表中数据可见，从0到5min，软骨片中Me2SO的浓度不但没有升高反而下降，5min之后才开始逐渐升高。经过120min的浸渗之后，软骨片中的Me2SO的浓度分别为60.31±1.07%w/v和59.80±1.54%w/v，没有达到平衡（假如由其它温度为类推以软骨片中Me2SO的浓度达到浸渗液浓度的90%作为浸渗平衡条件，则浸渗平衡浓度应分别为62.82%w/v和66.78%w/v）
表2经过指定时间之后软骨片中Me2SO的浓度
Tab.2 The concentration of Me2SO in AC discs over various exposure times
浸渗温度（℃） -40 -50
软骨片中Me2SO浓度（%w/v）
时间（min）
0 50.64±0.46 54.08±1.21
5 49.31±0.42 52.19±2.23
15 50.50±1.32 55.44±1.90
30 53.34±1.25 57.61±1.85
60 57.59±1.04 59.10±1.51
120 60.31±1.07 59.80±1.54
图2渗透奇特现象解释简图
Fig.2 A schematic used for the explanation of the Anomalous permeation
软骨片中Me2SO的浓度先下降然后才上升这一现象在-30℃及以上温度位的实验里未曾观察到[10]。对于这一奇物现象，我们的解释如下：
1）当浸渗达平衡时，组织内低温保护剂（CPA）的浓度达不到浸渗液的浓度，这一现象已在多种组织中发现，包括关节软骨[13]。造成这一结果的原因之一是组织内非溶剂水（不能溶解CPA）的存在，另外文献[13]指出组织与浸渗液间存在压力差（ΔP）也是原因之一。
2）由文献[14]知，Me2SO/H2O二元溶液的粘度在-30℃与-45℃之间有一个激增。在Me2SO的摩尔分数为0.2~0.4的范围内，-45℃时溶液的粘度是-30℃时的3.2倍左右。
根据上述依据（1），假设预平衡液的浓度为C2，预平衡之后软骨片中Me2SO的浓度为C1，则C1< C2（如图2（a）所示）。由依据（2），当把预平衡之后的软骨片浸渗于温度为-40或-50℃的浸渗液（假设浓度为C4）中时，软骨表面的起始浓度并非瞬间由C1（C3）升至C4（浸渗液浓度），即C1= C3< C4（如图2（b）所示）。另外，对于图2（b）再根据（1），欲要维持软骨片内Me2SO的浓度C1，则软骨表面Me2SO的浓度需要达到至少C2，而现在只有C3，故软骨片内Me2SO要向外渗出。当经过一定时间以后，假设软骨片内Me2SO的浓度下降至C1’，而表面浓度各式至C3，此时可视为Me2SO从向外渗出转为渗出入软骨片内的转折点。至此之后，Me2SO只会从浸渗液流向软骨片内。
至于为什么在-30℃及以上温度位未观察到此种奇特现象，可能是由于在这些温度位浸渗液的粘度还不是很大，致使软骨表面的Me2SO浓度很快即上升为浸渗液的浓度（这一变化过程所需时间少于实验所选取的时间间隔（5min）[10]）。
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